北京化工大学曾安平组ACS SynBio丨一种基于醛缩酶的新途径用于在大肠杆菌中转化甲醛和乙醇为1,3-丙二醇

遇见/摘要

碳一化合物（C1）如二氧化碳的生物利用是碳中和和绿色生物制造的关键技术。 CO₂ 可通过先转化为甲醇或甲醛进入生物合成，如通过醛缩酶的催化作用。这里，我们介绍一种在大肠杆菌中使用脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶（DERA）将甲醛和乙醇转化为绿色化学品1,3-丙二醇（PDO）的新型合成途径，PDO是合成PTT塑料的重要原料，生物合成方法多年来一直国外公司垄断，是影响我国塑料产业的“卡脖子”技术之一。DERA催化甲醛和由乙醇转化而来的乙醛的缩合并形成3-羟基丙醛（3-HPA），并进一步还原形成PDO。与所有其他已知的PDO合成途径（通常30-50% 的碳作为二氧化碳和其他副产物损失）不同的是，这一新途径为从C1化合物和C2化合物合成具有重要工业用途的C3化合物而无碳损失提供了可能性。 

图1 PDO新型生物合成途径示意图。

遇见/内容

在本实验室（曾安平组）于2019年发表在ACS Synthetic Biology的研究中，醛缩酶曾被用来利用甲醛和丙酮酸生产PDO。在该反应中，我们注意到，丙酮酸的羧基并没有直接参与该羟醛缩合反应过程，并且在后续的反应中该羧基被脱除了，实际上乙醛部分才是与甲醛形成C-C键的真正受体（如图2）。因此，我们推测存在某种醛缩酶, 它可以直接催化甲醛和乙醛生成3-HPA，并进一步转化为PDO。

图2 反应机理(丙酮酸的羧基并没有直接参与缩合反应) (A)及新酶发掘思路 (B)。ACALD:  acetaldehyde。

经过两轮对醛缩酶的筛选，我们得到了来源于海栖热袍菌的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶 (DERA_TMA)，与丙二醇脱氢酶共表达可以较为高效地实现体内甲醛和乙醛向PDO的转化，并且分别利用¹³C标记的甲醛和乙醛进行验证从而明确所得PDO完全来源于被该酶转化的甲醛和乙醛（如图3）。通过过表达乙醇脱氢酶构建乙醛供应模块，并敲除了frmA基因，在以甲醛和乙醇为底物时，PDO的产量达到0.97 g/L。我们也通过过表达甲醇脱氢酶构建甲醛供应模块，但由于甲醇脱氢酶活力的限制，以甲醇和乙醇为底物，在42 h时PDO产量仅达到0.08 g/L。

图3 利用GC-MS和¹³C标记的甲醛和乙醛验证PDO的合成。

已有文献报道DERA具有催化乙醛自缩合的能力，在上述转化过程中，我们也同样发现了一些二醇类副产物的生成。我们利用¹³C标记的乙醇对这些二醇类副产物进行鉴定，推断其形成路径如图4。

图4 推断的二醇类副产物合成图。

有趣的是，我们发现通过维持一定的甲醛浓度（在本实验中为0.6 mM）可以有效地避免这些二醇类副产物的产生。因此，我们在转化过程中多次补加甲醛以简单地维持其浓度，使得PDO产量提高至1.32 g/L，并且没有二醇类副产物的产生，这对利用该途径产PDO具有很重要的意义（图5）。

图5 以甲醛和乙醇为底物的补料批次转化用于生产PDO。

遇见/总结

在这项工作中，通过使用乙醛作为新型生物催化反应中的甲醛受体，丰富了C1化合物的应用。并且我们在利用该反应进行PDO生产时详细说明了三个代谢模块：基于DERA的PDO生产模块，乙醛供应模块和甲醛供应模块。从理论上讲，这一新途径为从C1和C2化合物在没有碳损失的情况下（即碳收率100%）合成具有广泛工业用途的C3化合物提供了可能性。

应该指出的是，目前使用的酶DERA_TMA对甲醛的亲和力 (K_m = 2.54 ± 0.07 mM) 和活性 (1.27 ± 0.02 U/mg) 仍然非常有限，对该酶的蛋白质工程和宿主菌株的系统代谢工程工作对于将C1化合物直接用于合成生物学中增值产品生产应具有非常重要的意义。此外，维持一定水平的细胞内甲醛对于避免乙醛的自聚合和其他二醇副产物的形成是重要的。值得一提的是，该途径的三个反应都是可逆的，尽管估计甲醛和乙醛缩合反应的标准吉布斯自由能为负 (-3.702 kJ / mol)，该反应在热力学上是有利的，但在进一步考虑时，驱动力或路径平衡可能是一个关键问题。北京化工大学软物质高精尖中心硕士研究生孟豪为本文的第一作者，德国汉堡工业大学曾安平教授以及农科院植保所任杰助理研究员为本文的共同通讯作者。